הרמב"ם כותב במפורש בהלכות תפילה (יד,יד): "במקדש מברכין ברכת כהנים פעם אחת ביום אחר תמיד של שחר, באין ועומדין על מעלות האולם ומברכין כדרך שאמרנו, אבל במדינה מברכין אותה אחר כל תפלה חוץ ממנחה...", הרי שלדעתו ברכת כהנים לא נאמרה אלא אחר תפילת שחרית.

אמנם מדברי הירושלמי במסכת תענית (פ"ד ה"א) משמע שאומרים ברכת כהנים גם במוסף: "מניין לנשיאות כפים? כה תברכו את בני ישראל. עד כאן בשחרית, במוסף? וישא אהרן את ידיו אל העם". ומהתוספות במסכת סוטה (לח,א) נראה שדעתם שמברכים בכל יום לאחר קרבנות התמיד והמוספים, ואלו דברי התוספות: "ולא הוה נשיאות כפים בכל יום אלא בעבודת תמיד כדתנן בפ"ה דסדר תמיד (דף לב:) דלאחר שנתנו איברים על גבי כבש ומלחום, ירדו ובאו להן ללשכת הגזית, אמר להן הממונה ברכו ברכה אחת והם ברכו קראו עשרת הדברות שמע והיה אם שמוע ויאמר, וברכו את העם ג' ברכות אמת ויציב ועבודה וברכת כהנים, והוא הדין במוספין ובתמיד של בין הערבים" (ראה מעשה רוקח על רמב"ם הלכות תפילה יד,יד; קרן אורה סוטה לז,ב ד"ה והתוס'. וראה גם באר שבע סוטה לח,א ד"ה וכתיב).

אמנם יש להעיר כי במשנה נזכרת פעמיים ברכת כהנים לאחר תמיד של שחר. אך יש להבחין בין שתי הברכות. במסכת תמיד מובא כי בין עבודת התמיד להקטרת הקטורת התכנסו הכהנים ובאו ללשכת הגזית ושם: "אמר להם הממונה ברכו ברכה אחת והן ברכו קראו עשרת הדברים שמע והיה אם שמוע ויאמר ברכו את העם שלש ברכות אמת ויציב ועבודה וברכת כהנים" (תמיד ה,א). ברכת כהנים זו אינה ברכת הכהנים בשם ה', אלא ברכה שהיא חלק מתפילת הכהנים. על פי הרמב"ם זו ברכת 'שים שלום' (רמב"ם הלכות תמידין ומוספין ו,ד), ועל פי דברי תוספות, היו אומרים את הפסוקים בלי ברכה (ברכות יא,ב). לאחר סיום הקטרת הקטורת והעלאת איברי התמיד מהכבש למזבח, היו הכהנים מברכים את ברכת הכהנים בשם המפורש על מעלות האולם (תמיד ז,ב; רמב"ם שם הלכה ה).